纖維素酶（cellulase，CL）活性測(cè)定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

CL（EC 3.2.1.4）存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi)，能夠催化纖維素降解，是一類可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保及可再生資源利用等領(lǐng)域的酶制劑。

測(cè)定原理：

采用蒽酮比色法測(cè)定CL催化纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、濃硫酸和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存； 臨用前加入 5mL 蒸餾水和 45mL 濃硫酸充分溶解待用。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

混勻， 90℃水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻，620nm 處蒸餾水調(diào)零，測(cè)定吸光值A，計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

CL 活力計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 5.018x - 0.0462；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 為吸光值。

2、血清（漿）CL 活力的計(jì)算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷V 樣÷T =39.8×(ΔA+0.0462)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 CL 活力的計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。

CL 活力(μg /min /g 鮮重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。 CL 活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=0.0796×(ΔA+0.0462)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.2mL； V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。