抗體和其它分子的共價標記

     以共價鍵結合的熒光染料FITC既能標記細胞內總蛋白、又能更廣泛地標記各種特異性配體。這些配體是能與不同的細胞結構很強很特異地結合的各種大分子和小分子，如蛋白、多聚核苷酸、脂類以及其他生物分子、被標記的特異性配體能夠探測很多種細胞結構和功能的參量。例如：被標記的外源凝集素可檢測細胞表面糖；被標記的抗體可檢測表面抗原；被標記的多聚陽離子可檢測表面電荷，被標記的激素、生長因子、神經遞質和病毒等可以檢測細胞受體；被標記的大分子、微生物或者塑料微球可檢測細胞內吞性；被標記的BrdU單克隆抗體可檢測細胞的DNA合成；用熒光素標記的親和素以及用帶有dUTP的生物素衍生物的DNA探針與靶DNA雜交能夠檢測原位的特殊基因。用這種技術，能夠追蹤感染的原因、致癌基因、基因缺陷，有助于發展原位雜交的程序和進行染色體分析。總之，利用熒光探針標記各種配體的方法是研究活細胞、死細胞和組織中的抗原、基因和各種生化過程的有力手段。

    對于抗體和其它配體分子共價標記的熒光探針除FITC外，近年來又發展了很多新的熒光探針，他們的一些理化特性和結構式，分別介紹它們的特性。

    FITC是zui常用的熒光共價標記物，它的一些特性已經在總蛋白含量一節中述及。此外，它易溶于水，很容易共價聯結在抗體、外源凝集素、抗生物素蛋白、激素、脂類、蛋白類似物以及其他生物分子上，每個被標記分子可標記2—8個熒光素分子。FITC有較高的消光系數和量子產額（在蛋白中為0.5），適用于氬離子激光器的488nm譜線激發。其缺點是所發射的熒光強度與pH有關，當pH低于8時，熒光顯著下降。另一個問題是FITC的激發波長處于產生自發熒光的光譜區，所以FITC熒光受到自發熒光的干擾。自發熒光是當受光激發時，末染色的細胞本身組分所發的熒光。FITC熒光主要受細胞內核黃素自發熒光的影響，測量時必須排除。

    另一種常用的共價標記探針是若丹明。若丹明比FITC光穩定性好，在生理條件不對pH變化不敏感，其熒光受細胞的自發熒光干擾較小。問題是不易溶于水，使其偶聯配體后熒光的量子產額較FITC低。TRLTC（Teteamethylrho damine isothioc yanate，四甲基異硫氰基若丹明）、XRITC（Rhodamine X isothiocyanate，異硫氰基若丹明 X）和Texas Red（德州紅）都是若丹明的衍生物，是常用的共價標記探針。FITC和TRITC是zui早使用的一組雙標記配體的熒光探針，前者發綠色熒光，后者發紅色熒光。但是由于FITC和TRITC的量子產額不匹配，（FITC遠大于TRITC），以及它們之間光譜范圍有較多交叉，容易產生能量轉移，因此以后又發展了XRITC和Texas Red。當用FITC和XRITC或者FITC和Texas Red作雙標記工作時，選用合適的兩組激光光源和濾片系統，可使兩種信號之間沒有多少光譜交叉。但也存在一些問題，例如由于XRITC的疏水特性，使與其偶聯的蛋白不易溶解，并且未與蛋白結合的染料也不易被洗掉。Texas Red有鈍化抗體的傾向，造成熒光信號較弱，現在多采用Texas Red標記抗生物素蛋白，這種標記物與生物素偶聯的抗體有*的親和力。

     藻膽蛋白是近年來用于免疫熒光分析和標記各類配體的一類新熒光探針。藻膽蛋白（Phycobiliprotein）是在光合藍藻（氰菌）和紅藻中發現的天然熒光色素家族。藻膽蛋白的色素基是后膽色素（Bilins），每個藻膽蛋白分子含有很多后膽色素。利用藻膽蛋白標記的優點是：對不同類型的藻膽蛋白可用不同波長范圍的光激發，但發射波長變化不大。由于藻膽蛋白分子具有許多發色團，它的消光系數和量子產額都很高。由于斯托克斯位移大，激發光和發射熒光容易被分開。藻膽蛋白易溶于水，熒光不易猝滅，對pH變化不敏感。此外，用雙功能交聯劑與抗體偶聯，不影響抗體的活性。但是藻膽蛋白的使用也存在些問題，例如由于藻膽蛋白的分子量很大，難于標記小分子以及細胞內的抗原或受體。

在各類藻膽蛋白中，PE（Phycoerythrin，藻紅蛋白）的分子量為240K，激發峰為490—560nm，發射峰為575nm；PC（Phycocyanin，藻青蛋白）分子量224K，激發范圍為580—620nm，發射峰為640nm；APC（Allophycocyanin，別藻青蛋白），分子量為110K，激發范圍為600—650nm，發射峰為680nm,用氬離子激光器的488nm激發藻紅蛋白，可得到較強的橙色熒光，所以可用PE和FITC對各種抗體或配體進行雙標記。

根據不同的來源，藻紅蛋白分為R-PE，S-PE和B-PE；藻青蛋白分為R-PC和C-PC等幾種類型。在同樣的條件下，若以488nm激發，S-PE溶液是FITC溶液熒光強度的19倍，是R-PE溶液熒光強度的2倍。來源于紅藻的藻紅蛋白（R-PE）強2倍。同樣，來源于某些紅藻的藻青蛋白（R-PC）比來源于其他紅藻或細菌的藻青蛋白（C-PC）對550nm的光激發效率高。

上述介紹的各種共價標記的熒光探針，根據它們光譜特性的區別，選擇性地使用激發光源和濾片系統，能夠對細胞進行多參量分析。氬離子激光器的488nm線和汞燈的485nm線用于激發熒光素、藻紅蛋白和碘化丙啶。氪離子激光器的568nm用于激發德州紅、染料激光器的600nm用于激發德州紅和別藻青蛋白。