聚丙稀酰胺等電聚焦電泳

目的要求

1、學習等電聚焦的原理

2、掌握聚丙烯酰胺等點聚焦電泳操作技術

實驗原理

    所有的氨基酸均為兩性物質，即它們至少含有一個羧基（carboxyl）及一個氨基（a-ami-no）。 這些可游離的基團隨著pH變化可以三種形式存在，即在電荷（cation）、兩性離子（zwit-terion）及負電荷（anion）等三種，在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負電荷。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場中不移動時，稱此pH值為它的pI值（等電點）。因為凈電荷為零，凈電斥力不存在的緣故，大部分蛋白質在等電點的pH值下，其溶解度zui小。相反的，當溶液的pH值低于或高于pI,所有蛋白質分子所帶凈電電荷為同號，彼此之間有相斥力，不會聚焦。所以，將pH調到等電點的大小，則大部分的蛋白質將會沉淀，這種現象可以應用于估算某蛋白質的等電點。另一方面，也可以應用在電泳，達到分離蛋白質混合物的目的，這種方法稱為等電聚焦電泳（isoelectric  focusing），簡稱為IEF。

    以A、B兩種蛋白質為例，做出它們的凈電荷曲線圖，橫軸代表環境中的pH值，縱軸代表蛋白質的凈電荷，在pH6.5時，A帶有兩個正電荷，B帶有一個負電荷。使A與B的凈電荷為0的pH值分別為pH9和pH5，這就是它們的等電點。

    IEF是在具有pH梯度環境中進行的電泳。將蛋白質置于不同pH梯度的膠體進行電泳，它會朝著與自身所帶電荷相反的電極方向移動，直到抵達等電點（pI）相同的pH值處才停止，如果它移到別的pH處，會因為帶電而再度移動到和它pI相符的pH處。

    IEF-PAGE操作簡單，只要一般電泳設備就可進行，電泳時間短、分別率高、應用范圍廣，可用于分離蛋白質及測定pI，也可用于臨床鑒別診斷、農業、食品研究等各種領域。

試劑和器材

1、試劑

    Acr-Bis貯存液：29.1g  Acr，0.9g  Bis，用無離子水溶解后定容至100mL，不溶物過濾去除后置棕色瓶，貯于冰箱。

   等電點標準蛋白（pH3～10）試劑盒，臨用前稀釋至0.1～0.3mg/mL。

   適合于pH3～pH10范圍的電極溶液：

（1）、陰極電極溶液（1mol/L、NaOH）。稱NaOH（AR）4g，加去離子水使其溶解，冷卻至室溫再定容至100mL。

（2）、陽極電極溶液（1mol/L、H3PI4）。取H3PO4（85%）6.7mL，加去離子水定容至100mL。

固定液：稱取磺基水楊酸3.5g，三氯乙酸10mL，甲醇35mL，加去離子水至100mL。

染色液：稱取考馬斯亮藍R250、0.1，冰乙酸10mL，甲醇35mL，加去離子水使其*溶解，再定容至100mL，過濾后置棕色瓶保存。

脫色液：取無水乙醇50mL，冰乙酸20mL，加蒸餾水至200mL。

保存液：取無水乙醇25mL，冰乙酸10mL，甘油5mL，加蒸餾水至100mL。

10%過硫酸銨，TEMED，40%兩性電解質載體（pH3～10）。

2、材料

    待測已純化的蛋白質樣品（脫鹽），濃度0.5mg/mL。

3、器材

    等電聚焦電泳槽，移液管（1，5,10mL），燒杯（25,50,100mL）細長頭的吸管，微量注射器（10uL或者50uL），漏斗，濾紙，鑷子。

操作方法

1、準備工作

    配制凝膠前，應把玻璃板準備好。即將兩塊干凈的玻璃板疊放在一起，之間夾上所需凝膠厚度的膠條進行密封。然后用文具夾將玻璃板四周固定好。注意夾子作用力點在膠條正中，以防漏膠。

2、配制凝膠

    取Acr-Bis貯備液2.0mL；兩性電解質0.5mL；去離子水5.5mL；TEMED  8uL置于小燒杯中混勻，再加入10%過硫酸銨50uL，用磁力攪拌器充分混勻2min。然后用注射器吸凈混合液，排除氣泡，緩緩注入玻璃板的夾隙內，注意勿出現氣泡。

3、電泳

（1）、、剝膠板。將膠板取出，揭去上層的玻璃板和膠條，然后用蒸餾水輕輕沖洗一下膠面。

（2）、點樣。用小紙條（0.5cm×0.5cm）蘸上，均勻地點在膠板上，點樣要求整齊、迅速。注意膠板兩邊要留出一定空間。通常把p1在酸性范圍的樣品放在偏堿性的位置（負極），P1偏酸性的樣品放在偏酸性的位置（正極），標準蛋白質混合樣品放在中間。

（3）、進樣。將浸入電極液的濾紙條取出，使其分別平直緊貼在膠面兩端，然后放入電泳槽內，注意正負極相吻合。將電極板正極（電極條浸有H3PO4的一側）與負極（電極條浸有NaOH的一側)分別與電泳儀的正、負極鏈接。接通冷卻水，在室溫下電泳，把電泳儀調至電壓50V，電流以每板膠不超過17mA為準，然后開始電泳。進樣時間一般在1.5～2h。

（4）、揭樣紙。待電流降至每板膠3mA以下時，切斷電源，取出膠板，揭去加樣紙后，將電壓調至220～320V斷續電泳。

（5）、加壓。當電流降至每板膠3mA以下時，升高電壓至580V，繼續電泳1.5h左右。

（6）、電流降至每板3mA以下時，切斷電源，停止電泳。

4、固定、染色和脫色

    將凝膠板放在培養皿中，加入固定液，浸泡數小時后，用脫色液清洗兩次，每次10min，然后加入染色液，室溫下放置15～30min，再用脫色液洗脫數次，直至譜帶清晰，放入保存液中浸泡10min，可制干板。

5、制作干膠板

（1）、取*浸濕的平整玻璃紙一張，于玻璃板上鋪平，紙與板之間不可有氣泡。

（2）、將凝膠鋪于上述玻璃紙上，對齊中心位置，使四邊留出距離相等，隨后將膠與紙之間的氣泡輕輕趕跑。然后，把另一張玻璃紙折起蓋在膠面上，并與下層玻璃紙對齊，膠與兩層玻璃紙之間要避免氣泡，要求光滑平整。

（3）、將凝膠四邊上下兩層玻璃紙貼緊，使膠邊邊緣上*沒有氣泡。然后將各邊的玻璃紙多余部分折向玻璃板反面。

（4）、置于室溫中自然干燥，*干燥后的膠板，手感如觸及玻璃板。這時，可將膠板揭下，截去邊角多余的紙，即可得一張圖譜清晰的干膠板。

注意事項

（1）、支持介質。在IRF-PAGE中，丙烯酰胺純度極為重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，則引起聚焦后pH梯度漂移，一般需用重結晶法進一步純化Acr及Bis。zui近，Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果較再結晶法更佳。

（2）、兩性電解質載體。兩性電解質載體是IEF-PAGE中zui關鍵的試劑，直接影響pH梯度的形成以及蛋白質的聚焦。因此，要選用的兩性電解質載體，在凝膠中，其終濃度一般為1%～2%。pH梯度的線性依賴于兩性電解質的性質，選擇哪種pH梯度范圍的兩性電解質載體，則與被分離蛋白質的pI有關。

（3）、樣品預處理與加樣方法。實驗證實，鹽離子可干擾pH梯度形成，并使區帶扭曲。為了防止上述影響，進行IEF-PAGE時，樣品應透析或用Sephadex  G-25脫鹽，也可將樣品溶解在水，或是低鹽緩沖液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白質在等電點附近，或水溶液及低鹽溶液中，溶解度較低，則可在樣品中加入兩性電解質，如加入1%甘氨酸或對1%甘氨酸透析。雖然甘氨酸是兩性電解質，但不影響pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶極距作用增加蛋白質的溶解性。此外，還可在樣品及凝膠溶液中加入無離子去污劑如Tween 80，Triton  X-100，Nonide P-40等或加入相同濃度的尿素（4mol/L），以免氰酸鹽引起蛋白質的氨甲酰化，含有尿素的樣品及凝膠板只能當天使用。

     加樣量取決于樣品中蛋白質的種類、數目及檢測方法的靈敏度。如用銀染色，加樣量可減少到1ug。一般樣品濃度以0.5～3mg/mL為宜，zui適加樣體積為10～30uL。如樣品很濃，可直接在凝膠表面加2～5uL；如樣品很稀，可加樣300uL。值得注意的是：對不穩定的樣品可先將凝膠進行15～30min預電泳，使pH梯度形成，然后將樣品放再靠近pI的位置以縮短電泳的時間，但不要將樣品正好加在pI處和緊靠陽、陰極的膠面上，以免引起蛋白質變性造成區帶扭曲。一般加樣電泳半小時后，取出加樣濾紙以免引起拖尾現象。

（4）、電功率、時間等因素。在IEF電泳中，隨著樣品的遷移越接近pI時，電流則越來越小。為使各成分能更好地分離，要保持一定的電功率，就應不斷增加電壓，電壓增高可縮短PH梯度形成，和蛋白質分離所需的時間，但過高的電壓會使凝膠板局部范圍過熱。因此，在電泳過程中，應通冷卻水，水溫以4～10℃為宜，流量5～10L/min。一般寬pH范圍電泳時間以1.5～2h為宜。