單向定量免疫電泳

目的要求

  了解單向定量免疫電泳的基本原理和方法

實(shí)驗(yàn)原理

    單向定量免疫電泳又稱火箭電泳（rocket  immunoelectrophoresis）。在瓊脂內(nèi)摻入適量的抗體，在電場作用下，定量的抗原泳動(dòng)遇到瓊脂內(nèi)的抗體，形成抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來。走在后面的抗原繼續(xù)在電場作用下向正極泳動(dòng)，遇到瓊脂內(nèi)沉淀的抗原-抗體復(fù)合物，抗原量的增加造成抗原過量，使復(fù)合物沉淀溶解，一同向正極移動(dòng)而進(jìn)入新的瓊脂內(nèi)與未結(jié)合的抗體結(jié)合，又形成新的抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來，不斷地沉淀-溶解-再沉淀，直至全部抗原和抗體結(jié)合，在瓊脂內(nèi)形成錐形的沉淀峰，稱火箭電泳。火箭峰的長度與標(biāo)準(zhǔn)抗原比較，可計(jì)算待測抗原的濃度。

    本實(shí)驗(yàn)以人血清作為抗原，免疫動(dòng)物（家兔）產(chǎn)生抗血清，當(dāng)適量抗原、抗體在瓊脂糖中擴(kuò)散，兩者相遇時(shí)，則形成抗原抗體復(fù)合物的白色沉淀線。不同的抗原分子與相應(yīng)的抗體分子的擴(kuò)散速度不同，當(dāng)兩者間比例適當(dāng)時(shí)，出現(xiàn)數(shù)目不同的沉淀線，根據(jù)沉淀線的出現(xiàn)可以定性抗原、診斷疾病或測定抗體的效價(jià)。

試劑和器材

1、試劑

    抗原：甲胎球蛋白（1～5mg/mL）。

    免疫血清（抗血清）：家兔抗人甲胎球蛋白血清。

    瓊脂糖（或進(jìn)口分裝瓊脂粉）。

    pH8.6電極緩沖液（巴比妥緩沖液）離子程度0.05u：取巴比妥1.84g，巴比妥鈉10.3g溶于蒸餾水，定溶至1L。制備瓊脂溶液時(shí)需要將上述緩沖稀釋1倍，離子強(qiáng)度為0.025u。

2、器材

  載玻片、打孔器、微量取液器、稀釋板、培養(yǎng)器或帶蓋培養(yǎng)皿。

操作方法

1、抗體瓊脂板的制備

    將融化的瓊脂冷卻到55℃，加入適量（看免疫血清的效價(jià)高低而定）的抗體，立即混勻（不要出現(xiàn)泡沫），將上述的抗體瓊脂（大約20mL）制成瓊脂板，冷卻后打孔備用。

2、加樣

   在各孔里加入不同稀釋度的抗原

3、電泳

    在平板電泳槽里倒進(jìn)離子強(qiáng)度u=0.05的巴比妥緩沖液。將凝膠板平放在電泳槽中的隔板上。瓊脂的兩端用浸溫的濾紙做橋與電泳槽的電極緩沖液相鏈接，抗體端接正極。通電，電流強(qiáng)度按瓊脂板的寬度計(jì)算（1～2mA/cm）。觀察到白色沉淀線時(shí)，即電泳完畢（一般1h左右）。一般通電后調(diào)電壓為10V/cm，或電流強(qiáng)度為2～4mA/cm時(shí)間約1～5h。

4、定量抗原

    在電泳一定時(shí)間后可以觀察到火箭狀的白色沉淀峰。電泳完畢后可以用肉眼觀察量出已知抗原量的各個(gè)火箭的高度，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可測出未知濃度的抗原量。如果計(jì)算的話，可用求積儀測定峰的面積。

注意事項(xiàng)

1、影響單向定量免電泳的因素很多，主要是要選擇好抗體濃度，使抗原抗體濃度比例合適。這就需要根據(jù)免疫血清的效價(jià)來定所加入瓊脂中的康體量，如效價(jià)高，則免疫血清瓊脂的比列為1:5～9，如效價(jià)低，則免疫血清與瓊脂的比列為2:5。

2、加入的抗體量要合適，以保證抗原、抗體的合適比例，以便形成清晰的沉淀峰?？贵w的準(zhǔn)確用量應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來決定，即加入不同量的抗血清，用一定量的抗原進(jìn)行火箭電泳，選出沉淀峰在2～5cm之間的相應(yīng)抗體濃度就是合適的抗體用量。