實驗室化學分析標準曲線的繪制

用生物藥物分析法（光譜法、色譜法與面議分析法）測定生物樣品中的藥物濃度時，都必須同時作標準曲線。盡管各種分析方法涉及的原理和方法技術有所不同，但標準曲線制備方法卻又共同的相似之處，如一般均采用空白生物基質中加入定量的藥物標準品混勻，配制成藥濃已知的標準生物樣品，然后與樣品同時測定，zui后用標準藥濃對響應值建立標準曲線。此外，生物藥物分析還常常面臨測定體液和器官（或組織）兩類性質不同的樣品，因此下面分別針對性的進行介紹

一  體液樣品（標準曲線制備）

體液樣品以血漿、血清為zui常用，下面以血清樣品為代表（并以苯妥英血清藥濃為例），說明體液樣品測定時標準曲線的制備方法。

苯妥英的有效血藥濃度為10-20mg/L(即10-20ug/ml），標準曲線濃度應涵蓋此范圍，測定時采用內標法（卡馬西平為內標）

1. 標準溶液的配制

苯妥英標準溶液（貯備液）的配制，精密稱取苯妥英標準品20mg，用0.1mol/l NaOH液溶解后定量轉移100ml容量瓶中，然后用蒸餾水溶解后同法定容成100ml。然后將配置的貯備液（含苯妥英0.2g/l，即20ug/100ul）置冰箱內4℃保存。

1. 內標（卡馬西平）溶液的配制 精密稱取卡馬西平標準品20mg，用甲醇溶解后定量轉移100ml容量瓶中，并加甲醇至刻度，置冰箱內4℃保存（含內標0.2g/l,即20ug/100ul）

說明：

對藥物純度的要求:目前很多藥物尚無標準品供應，由于生物藥物分析允許的誤差稍寬，因此一般可使用符合藥典標準的原料藥物作為標準品。藥典規定原料藥物含量一般在98%以上，只要按藥典規定方法干燥后，即可供配制標準溶液。對于其他含量規定較低的藥物或從制劑中提取出來的藥物，則需要經測定含量后，按實際含量配制成標準溶液

對內標純度的要求：與被測藥物一樣，通常內標也無標準品供應。用內標法定量時要求同一批樣品中（標準曲線各管與樣品各管）加入想等量的內標，而無需確知加入內標的準確量（因內標量不參與計算），不可求內標具有高純度與高含量，但要求齊化學組成恒定，試用期內穩定，并且不含干擾自身和被測組分（藥物與待測物）等色譜峰的雜質，這是對內標純度的基本要求。在實際工作中，常常遇到某藥物為合適的內標，卻無原料藥物可供使用的情況，此時可從該藥物的只制劑中提取，并適當精處理，只要無干擾分析的雜質村子，組成穩定，即可供作內保使用

標準溶液的稀釋

標準曲線擬用5個濃度點，稀釋時取潔凈、干燥的試管5支，分別編號為a b c d e 然后按下圖方法稀釋，使每管稀釋液中含苯妥英濃度分別為5.0、40.、2.5、2.0、1.0（ug/100ul）

說明：

為方便快速稀釋，應使用帶可更換塑料尖頭的定量移液管（微量取樣器）

倍數稀釋的原理：銀兩種水溶液混合時不會發生所容顯現，因此當標準溶液的體積苦熬大若干倍時，則藥濃降低相同倍數。所以可將濃貯備液或以稀釋后的貯備液按一定倍數比稀釋，得到所要求的藥物濃度，如于a管中先加入100ul貯備液（20ug/100ul）,軟后再加入300ul蒸餾水混勻，則叨叨5ug/100ul的稀釋液，又如于C管中加入200ul以稀釋好的a管內溶液（5ug/100ul)，然后加入200ul蒸餾水混勻，記得到2.5ug/100ul的稀釋液。稀釋時為確保準確的倍數比關系注意一下幾點

a、應使用干燥試管。

b、醫用同一支定量移液管吸取帶混合的兩種液體（藥物標準溶液和蒸餾水）,如此可避免移液管體積不準引入的誤差。例如，試管a內的稀釋：可用同一支100ul的移液管，先加入100ul貯備液（20ug/100ul），加入蒸餾水3次（100ul*3），混勻后得到5.0ug/100ul的溶液:蒸餾水的加入改用另一只大號移液管一次加入300u.l，則可能由于移液管本身體積的準確性使兩次加液體積比偏離（1:3）而引入倍數比誤差。

c、溶解藥物標準的溶劑硬件量用蒸餾水（或稀酸，堿溶液），引用蒸餾水稀釋時不會發生縮容現象，只有不溶于水的藥物，才能考慮使用甲醇或乙醇溶解。

   配置藥物標準血清濃度時沒分空白血清中擬加入100ul藥物標準溶液稀釋液，  因此上表第二欄 欲稀釋的藥物濃度以ug/100ul計。當然表中沒分空白血清中加入的藥物稀釋液體積也可改為（50ul)時體積的準確度稍差，二加入大體積優惠增大許晴樣品預處理的體積 ，因此習慣上以加入100ul較為適宜。

   上表是先弄配藥物標準品貯備液（冰箱保存）臨用時取少部分放至是問候在采用倍數稀釋法  使成所需濃度，其優點是貯備液長期保持冷貯并且開平次數少，可保持藥物及 其濃度的穩定，有趣事甲醇或乙醇配置時，多次開屏使其濃度發生改變，當然若經試驗證明吳穎賢，一顆照此法配成目標濃度后使用。

因沒分樣品中擬加入內標（卡馬西平）溶液100ul，配制濃度也用 ug/100ul標示。上面的介紹的方法是直接將卡馬西平賠償目標濃度，實際工作中可濃配后貯存，臨用時再行稀釋。

上表中zui后一欄各管內溶液體積，系全部稀釋完畢后個管內溶液的試劑體積。配置血清藥物標準濃度時見下表，自上表沒觀眾吸取100ul，為保證有足量供吸取，因此個管內的溶液應多于100ul。

藥物血清標準濃度的配制

制備標準曲線時，需用抑制藥濃的血清標準樣品，通常是現將苯妥英標準溶液稀釋成抑制濃度，然后取一定體積加入到空白血清中混勻，得到藥物血清標準濃度，配制時可照上表對應的苯妥英稀釋液100ul，即A管中加入a液（5.0ug/100ul）、B管中加入b液（4.0ug/100ul）、C管中加入c液（2.5ug/100ul）·····一次類推，S代表供測樣品管，內城血清樣品0.2ml，補加蒸餾水100ul，使與標準曲線各罐體及一致（均為0.3ml）。雖然此時體積均一致，但各管血清量實為0.2ml，因此認為管內的藥物量系0.2ml血清所含，換算成每ml計的血清藥物濃度分別為下表所示，

說明：

因為測定時擬用0.2ml血清樣品，因此標準曲線內加入空白血清量為1.2ml。測定時許晴樣品的去用量，應根據樣品實際含藥濃高低和測定方法靈敏度而定，含藥濃高者，許晴樣品用量可減少，具體取樣量應通過試驗確定，但無亂取樣量多少，標準曲線各管中加入的空白恤清涼英語樣品測定一致

上表中勒出1份樣品（S管）,實際測定時樣品數量較多。為使操作方便，可將樣品與標準曲線鎘濃度的編號，預先寫在小塊膠布條上，再將膠布條貼在是觀賞，當樣品管依照下表末欄補加蒸餾水之后，一下各管的預處理操作*相同，而預處理個步驟中常設計溶液的轉移，須更換試管，當試管內溶液轉入另一試管后，可將其上的膠布去下，隨即轉貼于新歡的是觀賞，如此有條不紊的驚醒預處理，可加快操作速度，保證與處理完畢后各管內容物對應于元血清樣品或標準曲線各管。

標準曲線制備與樣品分析

上表配置好苯妥英個許晴標準濃度，并將個許晴樣品補加100ul蒸餾水后于個觀眾分別加入內標溶液100ul（含20ul卡馬西平）,混勻后加入0.2ml磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L,ph7.5)及乙酸乙酯1.5ml，置旋渦混合發生器上萃取10分鐘后離心（200-2500r/min）。吸取上清液1.2ml入尖底試管，并將試管置于水浴中（35-40℃）通過壓縮空氣揮干，殘渣用30ul流動相重組，進樣20ul左色譜檢測，用色譜數據處理機記錄苯妥英和內標的峰高，并計算出各分樣品（血清樣品及標準曲線各濃度）的峰高比（苯妥英/內標），現以某次測定數據為例，測得的數據及處理見表14-4，以峰高比對苯妥英血清標準濃度作圖，得到的標準曲線見下表。

說明：

血清樣品中苯妥英濃度球閥：由14-3中待測血清樣品（S管）的峰高比（0./861），可直接沖標準曲線上查的血清樣品中苯妥英的濃度，也可將峰高比帶入回歸方程式計算后求得。

器官、組織樣品

器官、組織系半固體裝樣品，因此標準曲線制備與楊平測定方法有別于體液樣品，下面一動物肝臟內藥物分布量測定為例，賈少標準曲線制備方法、樣品測定以及藥物分布量計算方法。

1、用同種空白基質加藥物標準品制備標準曲線

測定動物肝臟內藥物分布量時，可另取健康動物肝臟，按照制備樣品肝勻漿相同方法作成空白肝勻漿。標準曲線制備時，扔參照前面提到的方法，知識用空白肝勻漿代替表中第3欄的空白許晴，尹云江的粘稠度與勻漿制備時外加的溶液里量多少有關，若加入量較少，則勻漿較粘稠，則取量可改用體積計，若加入量較少，則勻漿粘稠，則取量可改用重量，此時標準曲線橫坐標改為單位重量重要濃度。參照以上圖標A-E標準曲線各管中加入的空白肝勻漿量，亦是根據樣品分析時需要的肝勻漿量二區訂單的，（應與其等量），當于標準曲線個觀眾加入空白肝勻漿與樣品管中加入被測肝勻漿后，再按表14-2中第五欄和第六欄方法，于標準曲線個觀眾加入藥物標準溶液稀釋液100ul，于樣品管中加入等量的內標溶液混勻，取經過預處理后的溶液進行分析，一標準曲線各管得到的藥物色譜峰響應值，或藥物與內標色譜峰響應值之比（內標法）對標準曲線各濃度作圖，得到標準曲線，樣品肝勻漿中的藥物濃度，可由金陽后獲得的藥物峰響應值，從標準曲線上求得。

從上面標準曲線上得到的樣品勻漿中藥物的濃度（ug/ml或ug/g），做勻漿前可先稱定肝臟重量，做勻漿時記錄加入生理鹽水或其他溶液后的體積或重量，然后在制成勻漿，由此可知勻漿體積或重量與肝組織種之間的換算關系。當測定出勻漿中的藥物濃度后，便可換算成單位重量肝組織中韓藥量，進而得到整治肝臟內的韓藥量。用藥物標準溶液直接進樣簡歷標準曲線（共樣品*提取定容后測定用）

與藥物濃度測定相比，測定器官、組織中藥物的分布量時，需分析的樣品數量相對較少，并且不要求快速提供結果，因此可將藥物自生物材料中全部提取盡后定容，然后進行分析，直接沖標準曲線上得到對應的藥物濃度。

標準曲線的制備  可將藥物標準品溶液準確稀釋成4-5中濃度，然后自各濃度稀釋液取相同體積進樣，記錄藥物色譜峰響應值（峰高或峰面積），以藥物色譜峰響應值對藥物敬仰量（20ul內所含藥物量）作圖，級的標準曲線。此外也可曲線同一種濃度的標準溶液進行4-5次，每次進樣不同體積，同上以藥物色譜峰響應值對藥物進樣量（進樣體積內所含藥物量）左標準曲線，上述標準曲線的藥物量范圍，英語贗品分析先適應，即覆蓋樣品處理后進樣溶液內的藥物量。

藥物的*提取預定量 現將氣管，組織樣品照前述方法做成勻漿，然后準確取一定量置于試管中，加入緩沖液后用適當的有機溶劑漩渦混合萃取，林夕后分出有機溶劑層，如此反復萃取4-5次，直至將藥物萃取盡。將各次離心后分出的有幾層合并，定容后供進樣分析，若進樣分析后發現有干擾雜質，可將有機層用另一種緩沖液再行多次反萃，使藥物定量轉入水層，水層合并后定容，供進樣分析，由進樣后得到的藥物色譜峰響應值，從標準曲線上查的對應的腰五糧，再根據進樣體積與提取液定容體積。換算成提取液中的藥物量，此即為取量勻漿中含有的腰五糧，然后再換算成原器官，組織含藥物量、

為確定勻漿中的藥物萃取*需要的條件，可將定量的藥物標準品溶液加入空白勻漿中混勻然后再行萃取，以藥物能全部定量回收作為判斷指標，由此確定萃取時合適的溶劑種類、萃取次數、溶液PH,以及樣品是否需要蛋白處理等必要條件。