檢測原理

試劑盒采用競爭法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被瓜氨酸（Citrulline）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的競爭抗原，經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的瓜氨酸（Citrulline）呈負相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。

2.  標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行。

3.  植物萃取液或其它相關樣本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測。花生樣本處理方法：樣本去殼粉碎，稱取5g于100ml具塞三角瓶中，加入25ml 60%甲醇誰溶液和20ml正乙烷振蕩10min，濾紙過濾，棄去1/4初濾液，收集其余濾液于125ml分液漏斗中，靜置分層后放出下層60%甲醇水提溶液。現提取液2ml，加入2ml超純水稀釋，使提取液甲醇濃度為30%，此為樣品代測液。

4.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

酶標儀（450nm）

高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

37℃恒溫箱

操作注意事項

  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶溶解后再使用。

  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

  按照說明書操作時樣本已經稀釋5倍，最終結果乘以5才是樣本實際濃度。

  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、1、2、4、8、16 ng/mL

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.  樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的競爭抗原50μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

1.  15分鐘內在波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值；

2.  百分結合率計算：設S0管計數為B0，各標準管或樣品管計數為B，非特異管計數為NSB，則百分結合率計算公式如下：B/B0=(B－NSB)/(B0－NSB)×100%

3.  logit計算:各標準點或樣品管的logit值計算公式如下:logit=ln(B/B0)/(1－B/B0)

4.  將標準品的OD均值與標準品0點的OD均相除，為標準點的百分結合率，在log-logit坐標紙上繪圖。

5.  Log-logit雙對數標準曲線：坐標紙上橫軸從左至右一個1-9表示為一個10進位，第二個1-9表示為第二個10進位。第三個1-9表示為第三個10進位。坐標紙縱軸為百分比（1-99），即各標準吸光值的百分結合率。取一條通過各點的直線。要求盡可能多的點在線上，同時剩余的點均勻分布在直線的兩邊。樣品也同樣由吸光值計算百分結合率，再從縱軸上的相應結合率找到直線上的點，此點對應的橫坐標濃度即為樣品的濃度，無須換算。

6.  人工處理：以標準濃度取log值為橫坐標，對應的logit值為縱坐標在普通坐標紙上或以標準濃度為橫坐標，對應的B/B0為縱坐標在logit-log坐標紙上畫出標準曲線（理想化時是一條直線）。根據待測樣

品的B/B0可以從坐標紙上查出樣品的濃度值。如果使用普通坐標紙，查出的數值應取反對數才是最后的濃度值。

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度：檢測濃度小于0.25ng/mL。

3.  檢測范圍：0.1-16ng/mL。

4.  特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

5.  重復性：板內、板間變異系數均小于15%。

6.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

7.  有效期：6個月

免責聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。