微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

亞硝酸鹽廣泛存在于水體和土壤中，不僅是有機氮分解的重要中間產物，也可能來自污染。人體攝入過量后，可誘發消化系統癌變。

測定原理：

在酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸反應生成重氮化合物，再與 N-1-萘基乙二胺形成紫紅色偶氮化合物，在540nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器：

天平、常溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×2 瓶，室溫保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

1.土壤樣品：準確稱取過篩后的土壤約0.2g，加入 1.5 mL 提取液，室溫震蕩 1h，8000g， 25℃離心 15min，靜置，待其分層后，取上清液待測。

2.水樣：直接檢測；如果渾濁，可以離心后再測定。

測定步驟和操作表：

1、 分光光度計/酶標儀預熱 30min，調節波長至 540nm，蒸餾水調零。

2、 操作表

注意：空白管只需測定一次。

亞硝酸鹽含量計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線回歸方程為：y=0.234x + 0.0002，R2= 0. 999 

x 為標準品亞硝酸鈉濃度（μg/ml）                    

y為吸光值A。

（1）土壤樣品

 NO2-（μg/g）=（△A-0.0002）÷0.234×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×W）×0.6668

=（A – 0.086）÷0.234×1.5×0.6668÷W

=4.27×（△A-0.0002）÷W

（2）水樣

NO2-（μg/g）=（△A-0.0002）÷0.234×0.6668

=2.85×（△A-0.0002）

V 樣總：加入提取液體積，1.5 mL； V 樣：反應中樣品體積，0.07mL；W：樣品質量，g。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

標準曲線回歸方程為：y=0.141x +0.0002，R2= 0. 9991 x 為標準品亞硝酸鈉濃度（μg/ml）

y 為吸光值A。

（1）土壤樣品

NO2-（μg/g ）=（△A-0.0002）÷0.141×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×W）×0.6668

=（△A-0.0002）÷0.141×1.5×0.6668÷W

=7.09×（△A-0.0002）÷W

（2）水樣

 NO2-（μg/g）=（△A-0.0002）÷0.141×0.6668

=4.73×（△A-0.0002）

V 樣總：加入提取液體積，1.5 mL； V 樣：反應中樣品體積，0.07mL；W：樣品質量，g。

注意事項：

1.試劑盒 2-8℃保存。

2.試劑對人體有一定的危害，請穿實驗服，戴手套操作。

3.若檢測出得OD值在標準曲線范圍外，請將樣品進行適當的濃縮或稀釋（A540 <0.09 濃縮，A540 > 1.5 適當稀釋）。

4.低檢出限為 0.5μg/g