可見分光光度法正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入5mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體15mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體50mL×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說明：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解，此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量，還能在正常的多糖代謝、細(xì)胞壁組分代謝以及衰老時細(xì)胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解，釋放自由的半乳糖。

β-GAL分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL 活性。

自備用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1  的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定（在 EP  管中依次加入下列試劑）：

充分混勻，400nm 處測定吸光值 A，計算ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。三、β-GAL 活性計算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.32x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=62.5×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.125×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，0.5h。