分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，催化超氧化物陰離子

發生岐化作用，生成 H₂O₂ 和 O₂。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H₂O₂ 主要生成

酶，在生物抗氧化系統中具有重要作用。

測定原理：

通過氧化酶反應系統產生超氧陰離子(O^2-.)，O^2-.可還原氮藍四唑生成藍色甲

臜，后者在 560nm 處有吸收；SOD 可清除 O^2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應液藍色越深，

說明 SOD 活性愈低，反之活性越高。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 15mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 350μL×1 支，4℃保存；

試劑三：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量

（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提

取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超 聲 3s，間隔 10s，重復 30 次 ）；

8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，

加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 560nm，蒸餾水調零。

2、 將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍，用多少配多少。（試劑二和蒸餾水 1：1 稀釋）

3、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解（溶解后一周內用完），再用蒸餾水稀釋 4 倍，用多少

配多少（試劑四和蒸餾水 1：3 稀釋）。

4、 測定前將試劑一、三和四在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）水浴 5min 以上。

5、 樣本測定（在 EP管中依次加入下列試劑）：

試劑名稱（μL） 測定管 對照管

試劑一 240 240

試劑二 6 6

樣本 90

蒸餾水 90

試劑三 180 180

試劑四 510 510

充分混勻，室溫靜置 30min 后，加入 1mL 玻璃比色皿，560nm 處測定各管吸光值 A。

注意事項：

1、試劑二為酶，不可冷凍，使用時在冰上放置。

2、對照管只需要做一管。

3、若對照管吸光值大于 2，建議將試劑二用蒸餾水稀釋 7 倍后使用（10μL 試劑二原液+60μL

蒸餾水）。

4、SOD為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數值在什么范圍？

對照管的范圍是 0.8-2。對照管吸光值過低可能是（1）試劑二或試劑四沒有現配現用；

（2)沒有按順序加試劑；（3）反應時間不夠，可以延長反應時間（反應時間 30min可以延長

到 40min）。對照管吸光值過高可能是試劑二未按操作說明書稀釋相應倍數。

若出現測定管大于對照管，可能是樣本中雜質的影響太大，為了降低雜質的影響一般

將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10倍后再測，通常可以使測定正常。計算公式中

乘以相應稀釋倍數。