主要用途

    組織SRC激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過多肽底物受到SRC磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中SRC活性的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中SRC激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重500毫克組織重量 

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入XX毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （選擇步驟）抽去清理液

5． 移入到一個(gè)液氮凍存管

6． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

9． 加入置于冰槽里的XX微升裂解液（Reagent B） 

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>）

12． 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

15． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取XX微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入XX微升酶促液（Reagent D）

3． 加入XX微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入XX微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入XX微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

四、 樣品測(cè)定

1． 移取XX微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入XX微升酶促液（Reagent D）

3． 加入XX微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入XX微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升待測(cè)樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

五、 計(jì)算樣品活性 單位＝微摩爾NADH/分鐘

六、 酶標(biāo)板測(cè)定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取XX微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入XX微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入XX微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入XX微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入XX微升陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11． 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定

7． 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘

8． 光譜測(cè)定后，比色皿須清洗*

9． 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12． 可以使用SRC抑制劑（4-(4′-Phenoxyanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline；IC50=44納摩爾）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

13． Src激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品