可見分光光度法

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 90mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 5 mL 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5 mL 蒸餾水溶解。

試劑四：液體×1 支，-20℃避光保存。

產(chǎn)品說明：

TrxR 是一種 NADPH 依賴的包含 FAD 結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及 NADPH 共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR 與 GR 活性類似，催化 GSSG 還原生成 GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。

TrxR 催化 NADPH 還原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，但還原型谷胱甘肽與 DTNB 同樣能反應(yīng)生成 TNB，因此本試劑盒利用 2-乙烯吡啶抑制樣品中原有的還原型谷胱甘肽，通過測定 412nm 波長處 TNB 的增加速率，即可計算 TrxR 活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待檢測。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500  萬細(xì)胞加入1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3 s，間隔7s，總時間3min）， 然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

測定前將上清液與試劑四以 50：1 的體積比混勻（即取 100μL 上清液加入 2μL 試劑四混合）37℃ 水浴 30min 后至冰上。

二、TrxR 測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱 30 min 后，調(diào)節(jié)波長到 412nm，用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動物）預(yù)熱 30min。

3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 試劑二，100μL 試劑三，800μL 試劑一，迅速混勻后于 412 nm 測定 10 s 時吸光度，然后將比色皿放入 37℃水浴 5min 后混勻立即測定 310 s 吸光度，記為 A1 和 A2。△A 空白管=A2-A1。

4. 測定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100μL 試劑二，100μL 試劑三，700μL 試劑一，100μL 上清液，迅速混勻后于 412 nm 測定 10 s 時吸光度，然后將比色皿放入 37℃水浴 5min 后混勻立即測定 310 s

5. 吸光度，記為 A3 和 A4。△A 測定管=A4-A3。

三、TrxR 活性計算：

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位（U）定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol DTNB 還原為一個酶活力單位。

TrxR（U/mg prot）=（△A 測定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T

=0.147×（△A 測定管-△A 空白管）÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

活性單位（U）定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣品每分鐘催化 1μmol DTNB 還原為一個酶活力單位。

TrxR（U/g 鮮重）=（△A 測定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

=0.147×（△A 測定管-△A 空白管）÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位（U）定義：在25℃或者37℃中，每104 個細(xì)胞每分鐘催化1μmol DTNB 還原為一個酶活力單位。

TrxR（U/104 cell）=（△A 測定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V樣總)÷T

= 0.147×（△A 測定管-△A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

ε：TNB 在 412nm 處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總： 反應(yīng)體系總體積（L），1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），100μL=0.1 mL；T：反應(yīng)時間（min），5 min；W：樣品鮮重，g； V 樣總：提取液體積，1mL；細(xì)胞數(shù)量：以 104 為單位，以萬計。

注意事項:測定前須先取 1～2 個樣做預(yù)實驗，使得吸光值在 5min 內(nèi)程線性變化。哺乳動物組織及血液制品 TrxR 活力測定時，一般須用蒸餾水稀釋 5 倍左右；測定過程操作須迅速。