技術背景

細胞復制性衰老是細胞控制其生長潛能的保障機制。衰老細胞停滯在細胞周期的G1期，表現出細胞扁平、脹大、顆粒增多的形態特征，尤其在酸性條件下，細胞內β-半乳糖苷酶活性增加，而成為細胞衰老的生物學標記。

產品內容

清理液（Reagent A）     毫升

固定液（Reagent B）   毫升

酸性液（Reagent C）       毫升

稀釋液（Reagent D）   毫升

染色液（Reagent E）   毫升

產品說明書          1份

保存方式

保存染色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；稀釋液（Reagent D）和染色液（Reagent E）用鋁箔封裹，避免光照；有效保證6月

用戶自備

2毫升離心管：用于配制染色工作液

15毫升錐形離心管：用于配制染色工作液

恒溫培養箱：用于染色孵育

光學顯微鏡：用于觀察染色后的細胞

實驗步驟

操作一、25cm²細胞培養瓶染色

實驗開始前，將試劑盒里的染色液（Reagent E）從－20℃的冰箱里取出，放進冰槽里等待溶化。然后移取xx毫升稀釋液（Reagent D）到2毫升離心管，加入xx微升染色液（Reagent E），混勻后，放進37℃恒溫水槽里預熱，標記為染色工作液。然后進行下列操作：

• 小心抽去25cm²細胞培養瓶里的培養液
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），清洗生長中的細胞表面
• 小心抽去清理液
• 小心加入xx毫升固定液（Reagent B），覆蓋整個生長表面
• 在室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去固定液
• 小心加入xx毫升酸性液（Reagent C），清洗細胞表面
• 小心抽去酸性液
• 重復實驗步驟7和8一次
• 小心加入xx毫升染色工作液，覆蓋整個細胞表面
• 放進37℃培養箱，孵育3小時至16小時，或細胞呈現藍色（注意：避免液體蒸發）
• 在光學顯微鏡下觀察和計數：表達衰老特異性β- 半乳糖苷酶的細胞為陽性細胞，呈現藍色。

操作二、24孔細胞培養板染色

實驗開始前，將試劑盒里的染色液（Reagent E）從－20℃的冰箱里取出，放進冰槽里等待溶化。然后移取xx毫升稀釋液（Reagent D）到15毫升錐形離心管，加入xx微升染色液（Reagent E），混勻后，放進37℃恒溫水槽里預熱，標記為染色工作液。然后進行下列操作。

1．小心抽去24孔細胞培養板里的培養液

2．每孔加入xx微升清理液（Reagent A），清洗生長中的細胞表面

3．小心抽去每孔里的清理液

4．每孔加入xx微升固定液（Reagent B），覆蓋整個生長表面

5．在室溫下孵育5分鐘

6．小心抽去固定液

7．每孔加入xx微升酸性液（Reagent C），清洗細胞表面

8．小心抽去酸性液

9．重復實驗步驟7和8一次

10．每孔加入xx微升染色工作液，覆蓋整個細胞表面

11．放進37℃培養箱，孵育3小時至16小時，或細胞呈現藍色（注意：避免液體蒸發）

12．在光學顯微鏡下觀察和計數：表達衰老特異性β- 半乳糖苷酶的細胞為陽性細胞，呈現藍色

注意事項

• 本產品為100次（4個24孔板）或20次（20個25cm²細胞培養瓶）操作
• 操作時，須戴手套
• 本產品的參數：固著劑種類和濃度、pH、生色底物的選擇和濃度等達到優化
• 使用時，避免污染母液，否則出現絮狀沉淀，影響實驗效果
• 染色工作液避免光照
• 細胞β-半乳糖苷酶活性強，孵育3小時即顯示陽性；細胞β-半乳糖苷酶活性弱，則需要孵育24小時
• 細胞染色長孵育時間為24小時
• 孵育時避免液體蒸發
• 本產品染色敏感，甚至對于微弱表達的酶活性仍然顯色清晰；用戶可以根據實際情況調整孵育時間和染色工作液濃度，使染色恰到好處
• 細胞呈現藍色的部位為衰老細胞特異性β-半乳糖苷酶活性的地方
• 染色后的細胞樣品可以在4℃冰箱里長期保存，同樣須避免光照
• 本產品適合各種規格的培養細胞：載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和各種培養孔板，須相應調整處理液：

• 本公司提供系列細胞衰老分析試劑產品