主要用途

    冰凍切片皮爾斯（PERLS-DAB）非血紅素鐵（三價(jià)）強(qiáng)化染色試劑是一種旨在使用氰亞鐵酸鹽結(jié)合反應(yīng)技術(shù)，進(jìn)一步使用二氨基聯(lián)苯胺的強(qiáng)化擴(kuò)增，分析冰凍組織切片中三價(jià)正鐵離子（ferric ion）沉積現(xiàn)象的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心改良皮爾斯（Perls）方法、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于冰凍組織切片的三價(jià)正鐵離子檢測(cè)。廣泛用于動(dòng)物中樞神經(jīng)組織等病理生理的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

        三價(jià)鐵（ferric）是氧化數(shù)為三的鐵。通過(guò)無(wú)機(jī)礦物酸（mineral acid）水解，三價(jià)鐵從蛋白結(jié)合形態(tài)中釋放出來(lái)。三價(jià)鐵具有難溶性的特點(diǎn)。通常三價(jià)鐵先被還原使之與有機(jī)配位體分離，分離出來(lái)的二價(jià)鐵被生物體吸收。動(dòng)物和人體的整個(gè)消化道都可以吸收，植物在根尖處吸收。機(jī)體大約有三分之二的鐵存在于紅細(xì)胞的血紅蛋白和肌肉的肌紅蛋白中，20％的鐵以不同形式存在于肝、脾和其他組織中。鐵作為氧的載體，保證組織內(nèi)氧的正常輸送，在細(xì)胞生物氧化和能量代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。正常脾組織和骨髓里含有少量的三價(jià)鐵。組織中過(guò)量存在三價(jià)鐵，可能與血色病（hemochromatosis）和含鐵血黃素沉著癥（hemosiderosis）有關(guān)。由于中樞神經(jīng)組織中小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendroglia）和神經(jīng)元（neurons）以及非神經(jīng)組織含有非血紅素性三價(jià)鐵的輕度沉積，使用常規(guī)的皮爾斯（PERLS）方法敏感性不足，采用二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）的強(qiáng)化擴(kuò)增效應(yīng)，分析三價(jià)鐵沉積現(xiàn)象。通過(guò)酸性氰亞鐵酸鹽（ferrocyanide）與組織中三價(jià)正鐵離子（ferric ion）結(jié)合，成為亞鐵氰化鐵（ferric ferrocyanide），進(jìn)而催化二氨基聯(lián)苯胺的氧化，電子供體DAB失去電子，而呈現(xiàn)出顏色變化和沉積，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物。其反應(yīng)原理如下：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）  毫升

固著液（Reagent B）  毫升

染色液（Reagent C）  毫升

酸性液（Reagent D）  毫升

封阻液（Reagent E）  毫升

顯色液（Reagent F）  瓶

稀釋液（Reagent G）  毫升

反應(yīng)液（Reagent H）  毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書  1份

保存方式

保存顯色液（Reagent F）在-20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent C）和顯色液（Reagent F），避免光照；染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）具有腐蝕性和毒性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

2毫升離心管：用于工作液配制的容器

小型染色缸：用于石蠟切片的去石蠟和染色操作

光學(xué)顯微鏡：用于組織細(xì)胞染色后觀察分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣本固著處理
• 取出待測(cè)的5微米厚的冰凍切片  
• 小心加上xx微升清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個(gè)樣品表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 小心加上xx微升固著液（Reagent B），鋪滿整個(gè)樣品表面
• 室溫下，孵育10分鐘
• 小心移去切片上的固著液（Reagent B）
• 小心加上xx微升清理液（Reagent A），清洗樣品表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟7至8一次
• 樣本染色處理

操作開始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）置入室溫下，分別移出1毫升到2.2毫升離心管，混勻后，標(biāo)記為染色工作液，用錫箔紙包裹，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

• 小心加上xx微升染色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育30分鐘；或直至可見(jiàn)籃色
• 小心移去切片上的染色工作液 
• 室溫下，小心將切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A） 

三、 樣本顯色處理

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的顯色液（Reagent F）取出，加入xx毫升稀釋液（Reagent G），混勻，置入冰槽里；然后移取xx微升配制后的顯色液（Reagent F）和xx毫升反應(yīng)液（Reagent H）到2.2毫升離心管，充分混勻，標(biāo)記為顯色工作液，避免光照。  

• 小心加上xx微升封阻液（Reagent E）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育20分鐘
• 小心移去切片上的封阻液（Reagent E）
• 室溫下，小心將切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）（注意：須清洗干凈，否則影響下一步操作）
• 小心加上xx微升配制后的顯色液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育20分鐘，避免光照
• 小心移去切片上的顯色液（Reagent F）
• 小心加上xx微升顯色工作液在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育15分鐘，或直至肉眼可見(jiàn)棕黑色沉積，避免光照
• 小心移去切片上的顯色工作液 
• 室溫下，小心將切片置入xx毫升清理液（Reagent A）中孵育2分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：三價(jià)鐵沉積陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色 

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 操作時(shí)，須戴手套和防護(hù)面罩
• 建議在通風(fēng)柜里操作
• 所有操作在室溫下進(jìn)行
• 染色液（Reagent C）和酸性液（Reagent D）具有腐蝕性和毒性，注意操作安全
• 每次更換試劑溶液時(shí)，保持切片面基本晾干。空氣中晾干狀態(tài)為沒(méi)有水滴，呈濕潤(rùn)狀態(tài)，可見(jiàn)反光
• 試劑溶液在切片表面時(shí)，避免有氣泡存在，同時(shí)確保鋪滿切片表面
• 樣品染色避免過(guò)度，肉眼可見(jiàn)棕色即可終止染色
• 配制后的顯色液（Reagent F）避免反復(fù)凍融
• 顯色工作液不能儲(chǔ)存后使用；如果發(fā)現(xiàn)沉淀，不宜使用
• 組織細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察 
• 本公司提供系列組織細(xì)胞金屬元素染色試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰