在elisa試劑盒實驗中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本物和加結合物后，此時反應的溫度和時間應按規定的要求，保溫容器是水浴箱，可使elisa試劑盒實驗中的溫度保持平衡。elisa試劑盒實驗中各elisa板不應該疊在一起。為了避免蒸發，板上應加蓋，或者將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中，濕盒應該是金屬的，傳熱容易。

ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒實驗反應總是需要一定時間的溫育。

elisa試劑盒實驗中溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是elisa試劑盒實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些elisa試劑盒試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒實驗中一般不予采用。