肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)檢測(cè)試劑盒(肉桂酸比色法)產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

肉桂酸-4-羥基化酶是催化桂皮酸形成咖啡酸、香豆酸的酶，該酶多存在于高等植物、酵母、菌類(lèi)可溶性部分物質(zhì)，屬于細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量、提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)檢測(cè)試劑盒(肉桂酸比色法)檢測(cè)原理是以肉桂酸作為底物，在酶促反應(yīng)的適條件下采用每隔一定時(shí)間測(cè)定產(chǎn)物生成量的方法，于分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀290nm處檢測(cè)吸光度，以吸光度變化所需酶量進(jìn)行計(jì)算。該試劑盒主要用于植物組織的裂解液或勻漿液、血清等樣品中內(nèi)源性的肉桂酸-4-羥基化酶活性，尤其適用于檢測(cè)水果中肉桂酸-4-羥基化酶活性，100T該試劑盒可以檢測(cè)47~48個(gè)樣品。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1、蒸餾水

2、研缽或勻漿器

3、離心管或試管

4、低溫離心機(jī)

5、水浴鍋或恒溫箱

6、比色杯或 96 孔板

7、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀

操作步驟：

1、準(zhǔn)備樣品：

①植物樣品：取0.5g植物組織或水果中層果肉，加入2ml C4H Lysis buffer，冰浴情況下充分搗碎研磨或勻漿，4℃ 10000 r/min 離心15~20min，留取上清液，-20℃凍存，用于肉桂酸-4-羥基化酶的檢測(cè)。

②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，-20℃凍存，用于肉桂酸-4-羥基化酶的檢測(cè)。

③細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如果有必要需進(jìn)行適當(dāng)勻漿，4℃ 10000g離心15~20min取上清液，-20℃凍存，用于肉桂酸-4-羥基化酶檢測(cè)。

④高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的肉桂酸-4-羥基化酶，可以使用蒸餾水或C4H Lysis buffer 稀釋進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、配制NADPH 工作液：取1支 NADPH 加入1ml 蒸餾水，充分溶解，即為 NADPH 工作液。該NADPH工作液 4℃保存1周，-20℃保存2個(gè)月。

3、C4H加樣：按照下表設(shè)置對(duì)照管、測(cè)定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的C4H活性過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)能設(shè)置2平行管，求平均值。

4、C4H 測(cè)定：以對(duì)照管為對(duì)照(調(diào)零)，比色杯光徑 1cm，立即以分光光度計(jì)測(cè)定290nm處測(cè)定管的吸光度(記為A測(cè)定 0)。37℃準(zhǔn)確孵育1h。立即加入 0.1ml C4H終止液終止反應(yīng)，用C4H堿性基液調(diào)節(jié) pH 至約11(如用 pH 計(jì)檢測(cè)體積過(guò)小，亦可考慮用pH試紙，如無(wú)條件可省略該步驟)，以對(duì)照管為對(duì)照(調(diào)零)，比色杯光徑1cm，立即以分光光度計(jì)測(cè)定290nm處測(cè)定管的吸光度(記為A測(cè)定1)。注意：加入C4H 終止液終止反應(yīng)不是必須步驟，可37℃準(zhǔn)確孵育1h后直接以對(duì)照管為對(duì)照(調(diào)零)，比色杯光徑 1cm，立即以分光光度計(jì)測(cè)定 290nm 處測(cè)定管的吸光度(記為A測(cè)定1)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)，體積可相應(yīng)縮小，其余同分光光度計(jì)檢測(cè)操作。

計(jì)算：

C4H活性單位的定義：在該實(shí)驗(yàn)條件下，每1h吸光度變化 0.01 所需酶量為一個(gè)活性單位。

組織樣品 C4H[U/(g•h) ]=/(W×VS×0.01×t)

式中：A 測(cè)定1=孵育1h后測(cè)定管的吸光度

A測(cè)定0=加入C4H Assay buffer 后測(cè)定管的吸光度

W=組織樣品的重量(g)

VT=提取酶液的總體積(ml)

VS=測(cè)定時(shí)所用酶液體積(ml)

t=反應(yīng)時(shí)間(h)=1

液體樣品 C4H[U/(ml•h) ]=(A 測(cè)定 1-A 測(cè)定 0)/( VS×0.01×t)

式中：A 測(cè)定 1=孵育1h 后測(cè)定管的吸光度

A測(cè)定0=加入C4H Assay buffer 后測(cè)定管的吸光度

VS=測(cè)定時(shí)所用酶液體積(ml)

t=反應(yīng)時(shí)間(h)=1

注意事項(xiàng)：

1、 待測(cè)樣品中不能含有酶抑制劑，同時(shí)需避免反復(fù)凍融。

2、 獲得上清液為C4H 酶液，應(yīng)盡快檢測(cè)，亦可-20℃保存。

3、 加入C4H 終止液終止反應(yīng)后，采用 C4H 堿性基液調(diào)節(jié) pH 至 11 左右，以便檢測(cè)更為準(zhǔn)確，亦可考慮用 pH 試紙，如無(wú)條件可省略該步驟。

4、 C4H堿性基液具有一定腐蝕性，請(qǐng)小心操作。

5、 如果沒(méi)有分光光度計(jì)，也可以使用普通的酶標(biāo)儀測(cè)定，但本試劑盒不推薦用酶標(biāo)儀檢測(cè)，如需酶標(biāo)儀檢測(cè)每次檢測(cè)指標(biāo)不宜過(guò)多，否則操作時(shí)間不一，有可能導(dǎo)致樣本間的差異。

6、 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期：6 個(gè)月有效。